凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，它能从组织中清除不需要的、受损的或衰老的细胞。在正常细胞中，负性磷脂位于细胞膜的内侧，而膜的外表面则被不带电的磷脂（PS）所占据，当细胞进入凋亡状态后，带负电的PS从质膜的内叶向外叶运输，使PS暴露在细胞外环境中。人抗凝血剂Annexin V是一种35-36 kDa Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。Annexin V标记有荧光团或生物素，可通过与外叶PS结合识别凋亡细胞。
碘化丙啶（PI）是一种荧光核染料，对活细胞和凋亡细胞不敏感，但对死细胞有红色荧光染色，与细胞内的核酸结合紧密。Annexin V-AbFluor™ 488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒为细胞凋亡提供了一种快速简便的检测方法。在提供的结合缓冲液中，用Annexin V-AbFluor™ 488和PI染色细胞群后，早期凋亡细胞显示细胞膜绿色荧光，死细胞显示细胞核红色荧光和细胞膜绿色荧光。活细胞几乎没有荧光。此外，针对凋亡检测和结果的非标准化问题，本试剂盒还提供专利的细胞凋亡阳性对照品。检测可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行分析。
自备耗材
- 离心机、荧光显微镜或流式细胞仪
- 可调节式移液枪及枪头、去离子水、载玻片
- 细胞培养孔板
试剂准备
注意：各组分开盖前，请先低速离心。
1×Annexin V Binding Buffer：临用前配置，用去离子水把Annexin V Binding Buffer (5×)稀释成1×Annexin V Binding Buffer；未用完的试剂4℃可保存6个月。
Annexin V-AbFluor™ 488：即用型；使用前，平衡到室温；未用完的试剂分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。
Propidium Iodide (PI)：即用型；使用前，平衡到室温；未用完的试剂分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。
Apoptosis Inducer A：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
Apoptosis Inducer B：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
实验步骤
一、细胞凋亡阳性诱导
- 对于待诱导凋亡的培养细胞，分别按照与细胞培养液的体积比1:1,000-1:3,000的比例把Apoptosis Inducer A或Apoptosis Inducer B加入到培养液中（也可将Apoptosis Inducer A和Apoptosis Inducer B同时加入培养液中）。
- 在4、8、12、16或24 h后观察细胞凋亡的情况。通常16-24 h后，在光学显微镜下可以看到明显的细胞形态的变化，此时可以用于细胞凋亡染色观察（不同细胞可按实际情况调整诱导浓度及诱导时间）。
二、Annexin V-AbFluor™ 488/PI细胞凋亡检测
- 流式细胞仪分析
- 通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
- 4℃，300 g离心5 min收集1-2×105细胞，用冰预冷的PBS洗涤2次。
注意：贴壁细胞使用胰酶（不含EDTA）消化后离心收集细胞，消化时间如果过长，易造成细胞膜结构损伤而出现细胞坏死的假阳性，所以需控制胰酶消化时间。
- 用500 µL 1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞。
- 每500 µL细胞悬液中加入5 µL Annexin V-AbFluor™ 488和2 µL PI，轻柔混匀。
- 室温避光孵育15 min。
- 孵育结束后后置于冰上。染色后30 min内通过流式细胞仪分析细胞。使用491 nm和535 nm激发，517 nm（FITC通道）和617 nm（PE或PI通道）附近测量荧光。
- 荧光显微镜分析
- 对于悬浮细胞：
1）按照步骤A.1到步骤A.6的流式细胞分析步骤。
2）将步骤A.6的细胞悬浮置于玻片上，用盖玻片盖住细胞。尽快使用适当的滤镜通过荧光显微镜分析细胞（Annexin V- AbFluor™ 488可以使用FITC设置拍照，PI可以使用Cy®3或Texas Red®设置拍照）。
- 对于贴壁细胞，按照以下操作步骤：
1）细胞接种于爬片或腔室载玻片上，培养细胞。
2）通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
3）除去培养基，用预热或者室温的PBS洗涤细胞2次。
4）准备工作液：每100 µL 1×Annexin V Binding Buffer添加5 µL Annexin V- AbFluor™ 488和2 µL PI，轻柔混匀。
5）在细胞中加入适量的工作液（确保工作液完全覆盖细胞），室温避光孵育15 min（可以在冰上孵育，以减缓凋亡过程，但孵育时间需延长到至少30 min）。
6）用1×Annexin V Binding Buffer洗涤细胞2次。
注意：此步不要使用PBS洗涤细胞。
7）载玻片上添加一滴1×Annexin V Binding Buffer，然后将细胞爬片置于玻片上。对于细胞腔室载玻片上的细胞，添加足够的
1×Annexin V Binding Buffer覆盖细胞。
注意：也可使用抗荧光淬灭封片剂封片。
8）使用适当的滤光片在荧光显微镜下分析细胞。
| 中文名称 | 货号 | 规格 |
| Annexin V-AbFluor™ 488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 | KTA0002 | 50 T/100 T |
草莓时刻：除了基于细胞膜的变化检测细胞凋亡，细胞核、细胞质、线粒体的变化也能反映细胞凋亡情况。细胞质的变化主要有Caspase（KTA3020，KTA3023）的表达变化；线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件（KTA4001）；TUNEL法是基于细胞核断裂检测细胞凋亡的经典方法（KTA2010，KTA2011)。
实验结果展示
Figure 1. Hela 细胞用本试剂盒诱导剂诱导经 Annexin V-AbFluor™ 488/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒染色后检测的凋亡效果图。
FAQ
1．孵育结束后加入，做流式可以不加 1×Annexin V Binding Buffer 吗？
可以，加入 1×Annexin V Binding Buffer 的体积是根据流式细胞仪要求的上样体积来确定，如果细胞孵育悬液的体积足够，可以不
加入该 Buffer 来补齐体积。
2．试剂盒阳性对照如何设置？
根据说明书用试剂盒内提供的阳性试剂进行阳性诱导实验，如果诱导效果不明显，建议选用其它诱导剂（如喜树碱）进行诱导。
3．在加入 100μL Annexin V 结合缓冲液后，可不可以等到 60 min 左右再去做下一步呢?
因为这个实验是活细胞染色，先染完第一种染料，如果间隔时间太长，细胞活力会受到影响。
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| 货号 | 品名 | 推荐原因 |
| KTA2010 | 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光） | 检测细胞和组织的细胞凋亡 |
| KTA2011 | 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色色荧光） | 检测细胞和组织的细胞凋亡 |
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| KTA3022 | Caspase-3活性分析试剂盒（比色法） | Caspase-3活性反映细胞凋亡 |
| KTA3026 | Caspase-9活性分析试剂盒（比色法） | Caspase-9活性反映细胞凋亡 |
| KTA3020 | Caspase-1活性分析试剂盒（比色法） | Caspase-1活性反映细胞凋亡 |
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